Все области знания в равной мере необходимы, но некоторые из них важнее других. И биологию нам следовало бы поставить на первое место, так как ее цель — понять и объяснить сущность жизни.
Я убедился, что сок листьев, пораженных мозаичной болезнью, сохраняет свои инфекционные свойства даже после фильтрации через свечу Шамберлана.
Шел 1883 год, когда 19-летний Дмитрий Иосифович Ивановский поступил в Петербургский университет. Это было время, богатое событиями в области микробиологии, постепенно становившейся самостоятельной наукой. Кох уже открыл возбудителя сибирской язвы и стоял на пороге открытия возбудителей туберкулеза и холеры. Мечников уже был известен своим учением о фагоцитозе.
В 1884 году ученик Пастера Ш. Э. Шамберлан изобрел бактериальный фильтр, при помощи которого можно было освобождать различные жидкости от бактерий. Его соотечественник Милларде годом позднее ввел в практику бордоскую жидкость, уничтожавшую фитопатогенные грибы и тем самым спасавшую огромную часть урожаев.
В Петербургском университете молодой Ивановский имел возможность слушать выдающихся ученых — химика Д. И. Менделеева, ботаников А. Н. Бекетова и А. К. Фаминцына, оказавших на него значительное влияние. Он занимался очень усердно. Биограф Ивановского приводит такие строчки из его студенческого дневника: «Не могу понять, как можно сидеть с приятелем целый вечер и ничего не делать, говорить глупости и находить в этом удовольствие… Я устаю от вечера, проведенного в праздных разговорах».
Еще будучи студентом, Ивановский интересовался болезнями табака и изучал на Украине и в Молдавии распространение «рябухи», уничтожавшей урожаи табака. Позднее, уже как сотрудника университета, его особенно заинтересовала мозаичная болезнь табака, названная так в 1886 году голландским агрономом А. Э. Майером из-за мозаичного расположения темно- и светло-зеленых пятен на листьях табака.
Ивановский повторил опыты Майера. Листья больных растений он растер в фарфоровой чашке, их сок процедил сквозь полотно и при помощи капиллярных трубочек впрыснул эту жидкость в жилки здоровых листьев табака. Через две недели 80 % инфицированных растений были поражены мозаикой. Дальнейшие результаты, полученные Ивановским, уже отличались от тех, что содержались в сообщении Майера. После пропускания сока через фильтр Шамберлана, задерживающий бактерии, инфекционные свойства сока сохранялись, хотя Майер утверждал, что после такой фильтрации они исчезают.
На заседании Императорской Санкт-Петербургской Академии наук в 1892 году Д. И. Ивановский доложил о результатах своих опытов. В заключение доклада он высказал гипотезу, что мозаичная болезнь табака бактериального происхождения и что фильтрат, прошедший через свечи Шамберлана, содержал либо мельчайшие бактерии (способные проникнуть через этот фильтр), либо токсин, выделенный бактериями и способный вызвать мозаику у здоровых растений.
Предположение о токсине привлекало своей вероятностью: ведь за четыре года до этого французские бактериологи Э. Ру и А. Йерсен на примере дифтерии показали роль бактериальных токсинов при инфекционных заболеваниях. Все общие болезненные явления, вызываемые дифтерией, были воспроизведены у животных путем впрыскиваний одного дифтерийного токсина.
Независимо от Ивановского шесть лет спустя такие же результаты получил Бейеринк в Высшей политехнической школе в Делфте. Однако свое сообщение, датированное 1898 годом, он закончил выводом, отличавшимся от предложенного Ивановским. Бейеринк утверждал, что, во-первых, мозаику табака вызывают не микробы, a «contagium vivum fluidum» (жидкое заразное начало), или, короче, фильтрующийся вирус (термин «вирус» употреблялся в то время в значении возбудителя, инфекционного начала любой болезни); во-вторых, вирус размножается лишь в живых органах растений, и, в-третьих, вирус можно уничтожить кипячением, но при высушивании его вирулентные (инфекционные) свойства сохраняются.
Еще через четыре года Ивановский в своей докторской диссертации несколько иронически упомянул о неосведомленности Бейеринка: ведь он (Ивановский) уже доказал, что сок из больных листьев сохраняет свою вирулентность после прохождения через фарфоровые свечи (фильтр Шамберлана). Отрицал он и положение Бейеринка о том, что возбудителем инфекции является жидкость, настаивая на своем утверждении, что речь идет о мельчайших инфекционных частицах. В статьях, опубликованных позже в Германии, Ивановский продолжал развивать теорию, отрицающую предположение о том, что возбудитель мозаичной болезни табака — жидкость (contagium fluidum), и доказывающую, что им должно быть твердое инфекционное начало (contagium fixum). Он также выражал надежду, что в течение ближайших 2–3 месяцев сможет опубликовать данные о возможностях искусственного культивирования возбудителя болезни. В следующей работе он применял, однако, более осторожную формулировку, говоря, что искусственное выращивание микроба мозаичной болезни является задачей дальнейших исследований.
Оба ученых были отчасти правы, но отчасти и ошибались. Возбудителем мозаики оказалась не бактерия, как утверждал Ивановский, но и не жидкое заразное начало, как предполагал Бейеринк. Этим возбудителем был, если говорить словами Ивановского, contagium fixum — твердое начало, но размножающееся лишь в живых органах растений, как и полагал Бейеринк. Сейчас, по прошествии многих лет, мы можем сказать, что в то время этот вопрос еще не созрел для окончательного решения… А термин «фильтрующийся вирус» надолго удержался и лишь значительно позднее стал применяться в сокращенной форме — просто «вирус».
Спустя годы были открыты и другие фильтрующиеся вирусы, вызывающие болезни растений. Немецкие «охотники за микробами» Ф. Леффлер и П. Фрош доказали, что различные формы ящура крупного рогатого скота — это болезни, вызываемые фильтрующимся вирусом. Вскоре стало известно, что и желтая лихорадка, сеющая смерть среди населения южных стран, — тоже вирусное заболевание.
Так среди «охотников за микробами» постепенно выделилась особая группа исследователей, ищущих этих новых «врагов жизни», которые представляли тем большую опасность, что их нельзя было обнаружить даже в самом совершенном световом микроскопе. Только в 30-х годах, когда был сконструирован электронный микроскоп, группа ученых под руководством Фуска впервые увидела вирус табачной мозаики (1939). Но вирусы уже готовили для ученых ряд новых неожиданностей.
Еще в период первой мировой войны удалось установить, что вирусы — враги не только человека, животных и растений; они являются также невидимыми противниками бактерий.
Английский микробиолог Ф. Туорт при выращивании белого стафилококка (Staphylococcus albus), встречающегося обычно на коже человека и его волосах, заметил, что некоторые колонии этого микроба на твердой питательной среде растворялись. Первоначально эти колонии имели обычную молочно-белую окраску, потом постепенно становились прозрачными и наконец совсем исчезали. Туорт перенес капельку массы этой исчезающей колонии на нормальную — она тоже стала «растворяться» и исчезла. Он посчитал это за проявление деятельности какого-то невидимого паразита, вызывающего распад бактериальной колонии.
Года через два после опытов Туорта канадский микробиолог Ф. д'Эрелль заинтересовался судьбой бактерий, вызывающих дизентерию. Они выделяются из организма больного вместе с испражнениями, а потом очень скоро исчезают. Инфицировав мясной бульон в пробирках небольшим количеством кала от нескольких пациентов, он оставил их открытыми на ночь при температуре 37 °C, а на другой день содержимое пробирок профильтровал через бактериальный фильтр. Капли полученного фильтрата он нанес на новую среду с чистой культурой микроба Shigella dysenteriae и наблюдал, как дизентерийные бактерии постепенно исчезали вокруг капель фильтрата. Повторив опыт несколько раз, он убедился, что в фильтрате находились какие-то живые «ультрамикробы», проникающие даже через бактериальный фильтр. Они нападали на клетки бактерий и уничтожали их. Ученый предположил, что имеет дело с живым организмом, сходным с фильтрующимся вирусом. А поскольку последний, по-видимому, питался бактериями, он назвал его бактериофагом, что означает «пожиратель бактерий».
При дальнейших исследованиях выяснилось, что бактериофагов существует много и действуют они на различные бактерии, причем один тип бактериофагов умерщвляет только один определенный вид бактерий. О некоторых из них мы узнаем подробнее в следующих главах.
В 1939 году невидимый дотоле вирус табачной мозаики стал видимым благодаря электронному микроскопу. Потом очередь дошла и до других вирусов. Были установлены их размеры и форма.
Вирус табачной мозаики (сокращенно его принято обозначать ВТМ) при наблюдении под электронным микроскопом оказался продолговатой палочкой длиной около 300, а шириной 18 нм (фото 35). Размеры других вирусов варьировали в пределах размеров ВТМ.
Бактериофаги отличаются очень интересной формой (фото 36 и 37). Один из них, фаг Т2 — «паразит» кишечных бактерий Escherichia coli, — напоминает формой булаву. При нападении на клетки Е. coli он прикасается к ним хвостовидным придатком.
По своим размерам вирусные частицы занимают место между наименьшими живыми клетками и самыми крупными молекулами химических соединений:
Уиндел М. Стэнли, профессор Калифорнийского университета, так характеризует место вирусов:
«В конце XIX века были известны живые организмы различных величин — от самой мелкой бактерии до самого крупного кита. Молекулы химических соединений варьировали по размерам от крупных сложных белков до мельчайшей двухатомной молекулы газообразного водорода. Но между известными биологам организмами и неживыми молекулами химиков лежала целая пропасть. Ничто живое не могло быть мельче мельчайших возбудителей плевропневмонии, размеры которых были около 150 нм. Не было известно химической молекулы крупнее 22 нм. Миры биологов и химиков были, таким образом, резко отграничены друг от друга по величине изучаемых объектов. Но в 1898 году был открыт организм, более мелкий, чем любой из известных живых организмов, нечто такое, что было способно к размножению и вызывало болезнь растений табака. А в 1935 году была выделена и описана молекула, значительно более крупная, чем молекулы всех известных нам соединений. И этот наименьший организм и эта самая крупная молекула были одним и тем же существом — вирусом табачной мозаики. Вирус табачной мозаики… заполнил промежуток между видимыми в то время глазу человека отдельными биологическими и химическими объектами. Эту принадлежность к граничной области жизни, лежащей между живым и неживым, подтвердили и другие вирусы, открытые в первые десятилетия нашего века. Они не только заполнили просвет между организмами и молекулами, но и вышли за его границы.»
М. Бейеринк назвал вирусы жидким живым заразным началом. Однако под электронным микроскопом мы увидели, что это тельца определенных очертаний. Еще за четыре года до того, как ВТМ впервые наблюдали в электронном микроскопе, молодой американский биохимик У. М. Стэнли высказал сомнение по поводу жидкой природы вируса. Интуитивно он предполагал возможность белковой природы этих существ.
Для проверки своего предположения Стэнли использовал целую тонну пораженных мозаикой листьев табака. Растерев и отжав из них с помощью пресса сок, он очистил его и исследовал на содержание белков. В результате он получил небольшое количество («ложечку») микроскопических иглообразных кристаллов. Исследования показали, что главная составная часть этих кристаллов — белки, являющиеся одновременно и вирусом табачной мозаики.
В настоящее время, как говорит Стэнли, этот опыт можно сравнительно легко повторить. Сок из больных листьев должен отстояться, затем его пропускают через фарфоровый фильтр, снова отстаивают и подвергают очистке. В полученную прозрачную жидкость вводят сульфат аммония, и она начинает свертываться, мутнеет. В ее капельке под микроскопом видны тонкие кристаллики ВТМ.
Но вирус ли это? Стэнли представляет доказательства: стоит растворить кристаллы в воде, опрыснуть полученным раствором здоровые листья табака, и через некоторое время на них появятся симптомы заболевания. Десятки тысяч вирусных частиц, которые находятся в каждом кристалле, при растворении его в воде рассеиваются в ней, а попав на растение, продолжают свою вредоносную деятельность.
Но действительно ли эти кристаллы представляют собой чистый белок, как предполагал Стэнли? Химический анализ показал, что его предположения верны. ВТМ — белок и к тому же способен образовывать кристаллы. Значит ВТМ «живые кристаллы»? Представление это с трудом укладывалось в сознании ученых.
Однако Стэнли был не совсем прав, утверждая, что вирус представляет собой чистый белок. Спустя два года английские биохимики Ф. Ц. Боуден и Н. X. Пири установили, что ВТМ лишь на 95 % состоит из белка. Остальные 5 % приходятся на нуклеиновую кислоту — так называли тогда сложные соединения, обнаруженные впервые в ядрах живых клеток. Комбинацию нуклеиновой кислоты с белком химики называют нуклеопротеидом. Значит, ВТМ — нуклеопротеид.
Позднее было доказано, что все вирусы представляют собой комбинацию белков с нуклеиновыми кислотами. Были также выявлены два типа нуклеиновых кислот у вирусов. Одни вирусы содержат только РНК, рибонуклеиновую кислоту, другие — исключительно ДНК, или дезоксирибонуклеиновую кислоту. Известные нам вирусы растений содержат РНК, так же как и вирусы полиомиелита и гриппа. Для большей части вирусов животных характерна ДНК.
Стэнли за свое открытие белково-нуклеиновой природы вирусов был удостоен Нобелевской премии. Приверженность к вирусологической тематике он пронес через всю жизнь. Вплоть до кончины он возглавлял в Калифорнийском университете Лабораторию вирусов, вокруг которой группировались десятки исследователей-энтузиастов, изучавших вместе с ним «тайну жизни» вирусов. В рабочем кабинете Стэнли хранится реликвия — стеклянный сосуд с кристаллами, полученными в 1935 году, но и сейчас способными вызвать болезнь табака.
На вопрос, какие явления характеризуют жизнь, биологи отвечают, что каждый живой организм имеет специфические форму и величину, внешнюю и внутреннюю организации, с которыми связана и специализация отдельных органов; живому организму свойственны движение, реакция на внешние раздражения, рост, процесс обмена веществ и, наконец, такая важная особенность живых организмов, как способность размножаться. С размножением связана и возможность наследственных изменений.
Впрочем, некоторые из перечисленных критериев жизни можно обнаружить и в неживой природе. Мы найдем в ней и известную степень организации, и движение, и реакцию на раздражение, и рост. У кристаллов поваренной соли есть внешняя и внутренняя организации; протекающие в них химические реакции — своего рода проявление реакции на раздражение, то есть чувствительности; кристаллы и ледники растут; все тела фактически находятся в движении. Если такое движение и не проявляется наглядно, то постоянно движутся молекулы и атомы.
Однако неживые предметы не могут размножаться, следовательно, у них нет наследственных изменений. Таким образом, живое от неживого отличается прежде всего тем, что может размножаться и изменяться от поколения к поколению.
Посмотрим с этой точки зрения на вирусы и попытаемся разобраться, живые это существа или неживые. Химику они напоминают крупные молекулы, способные к кристаллизации. Есть у них и черты, общие с живыми организмами, — они могут размножаться (но только внутри живых клеток) и, как доказано в последнее время, подвергаться наследственным изменениям. Эту двойственность, это сочетание свойств как существа, так и вещества, подчеркнул Т. Риверс, когда называл их «органулами» или «молекизмами» (комбинация слов: организм и молекула).
Как мы увидим, вирусы имеют не только определенную форму и величину, но и внутреннюю организацию, выражающуюся в определенной структуре белка и нуклеиновой кислоты. Однако они значительно проще клеток. Между самыми крупными вирусами и самыми мелкими бактериями также существует некоторый «просвет» в размерах. По величине этот просвет могли бы занять риккетсии — организмы, ведущие, так же как и вирусы, паразитический образ жизни внутри клеток своих «хозяев». Но эти уже ярко выраженные клеточные организмы примитивнее бактерий и раза в два крупнее самых крупных вирусов.
Так куда же следует относить вирусы — к живым или неживым образованиям? Стэнли так ответил на этот вопрос:
«Живые ли они или неживые — об этом можно спорить до бесконечности, не получая, по существу, удовлетворительного ответа на поставленный вопрос. В одном отношении вирусы схожи с живыми организмами, в другом — с обычными химическими молекулами, но отличаются как от первых, так и от вторых. Их двойственный характер и сравнительно примитивная структура, которую мы в состоянии уже довольно подробно изучать, дают нам возможность видеть в них, с одной стороны, живые существа, а с другой — химические молекулы, способные к размножению. Тем самым мы приближаемся к пониманию химической сущности процесса размножения, протекающего во всех других живых организмах. Кроме того, изучение вирусов открывает перед нами новую перспективу, поскольку мы видим не две якобы резко отделенные друг от друга группы, а лишь их все более возрастающую сложность. С точки зрения структуры — имеем возможность проследить весь ряд тесно связанных между собой объектов: от атома через простую молекулу, макромолекулу, вирус, бактерию и далее через рыб и млекопитающих вплоть до человека. С функциональной точки зрения — можем наблюдать процесс использования энергии от случайного движения различных молекул до идеальной гармонии тончайших биологических ритмов».
Вирусы, эти крупнейшие молекулы и в то же время наименьшие формы живой материи, имеют одну общую характерную черту: все они являются существами, паразитирующими в клетках живых организмов (фото 39). Вирусология знакомит нас с вирусами растений, животных и микробов. Из вирусов — паразитов бактерий — мы знаем уже несколько типов бактериофагов. Многие еще, несомненно, будут открыты. Вирусной инфекции подвержены даже некоторые грибы. При парниковом выращивании шампиньонов уже давно обращали внимание на болезненные симптомы на шляпках и ножках грибов. Заболевание отражалось и на общем урожае шампиньонов. В Великобритании, где ежегодно их выращивают до 17 000 т, болезнь нанесла большой ущерб. Только во второй половине 50-х и в начале 60-х годов английские ученые Холлингс и Гэнди точными опытами доказали, что возбудителями этой болезни являются вирусы, которых им удалось выделить и изучить с помощью электронного микроскопа. Один из вирусов, паразитирующих на грибах, может быть использован в борьбе против вирусного же заболевания животных, так как с его участием в организме животного образуется интерферон. Об интерфероне и его значении будет рассказано в пятой части нашего путешествия в страну микробов.
Природа удивительным образом проявляется гораздо сложнее и интереснее, чем мы могли бы вообразить.
В 1946 году Стэнли была присуждена Нобелевская премия за открытие явления кристаллизации ВТМ. К тому времени уже были известны и другие кристаллизующиеся вирусы, полученные последователями американского биохимика из больных растений.
Спустя двадцать лет сотрудники Лаборатории вирусов Калифорнийского университета добились дальнейших значительных успехов: они кристаллизовали животный вирус, причем один из самых мелких — вирус полиомиелита. Этот период характеризуется бурным развитием вирусологии. Вирусологи научились не только обнаруживать возбудителей вирусных заболеваний, но и культивировать их. Сначала для этих культур использовали подопытных животных, позже стали применять зародышей цыплят, а затем и искусственные культуры тканей из организма животных (фото 40).
Сотрудники упомянутой Лаборатории вирусов выращивали вирус полиомиелита на культуре ткани из почек обезьяны. Искусственные ткани культивировались на питательной жидкости, а в их клетках жили и размножались частицы вируса полиомиелита. Дальнейшим этапом было выделение вируса, и основными «рабочими орудиями» для этого служили ультрацентрифуга и электронный микроскоп. На дне центрифужных пробирок при скорости в несколько десятков тысяч оборотов в минуту из фильтрата питательной жидкости постепенно оседали невидимые простым глазом частицы вируса полиомиелита. Полученная суспензия была исследована под электронным микроскопом. Комбинацией различных химических методов ученым удалось наконец достигнуть намеченной цели — выделить один-единственный кристаллик вируса (фото 41, а). Из миллионов частей культуральной жидкости только три части приходились на вирус. Интересно было рассмотреть скол такого кристалла (фото 41, в): электронный микроскоп вскрыл правильное расположение отдельных частиц вируса. Чтобы образовать один едва видимый в микроскоп кристаллик, потребовались миллиарды этих частиц!
Через год ученым удалось кристаллизовать уже три известных типа вируса полиомиелита. Это было как раз в том году, когда Р. Л. Стире установил, что ВТМ кристаллизуется не только в искусственных условиях, его кристаллы образуются и в клетках пораженных растений.
Немного позднее вирусологи К. Ф. Маттерн и X. Дюбуа опубликовали сообщение о получении кристаллов вируса Коксаки (фото 42).
К настоящему времени вирусологи открыли уже несколько сотен вирусов. Из них в относительно очищенном виде выделены примерно 30, а около 20 вирусов получены в абсолютно чистом виде.
Вирус табачной мозаики изучен гораздо лучше других вирусов. Его размеры и форма нам уже хорошо известны. Но каково внутреннее строение частицы этого вируса?
Рибонуклеиновая кислота находится в вирусной частице в виде простых спиралей, которые скрыты в цилиндре, представляющем макромолекулу белка. Внутри частицы имеется полый «канал», как у изолированного провода, из которого вытянули проволоку. Диаметр этого канала достигает 4 нм (фото 43).
Макромолекула белка состоит из мелких пептидных цепей (субъединиц); в каждой частице ВТМ их в среднем около 2200. Эти цепи, образующие как бы «плащ» поверх спирали РНК, представляют более крупную спираль, внешний диаметр которой равен 17–18 нм. С каждым оборотом спирали на 360° в белковом «плаще» прибавляется 16 1/3 новых пептидных цепей и длина его увеличивается на 2,3 нм. Общее число витков около 130.
Цепи, из которых состоят белки, химически всегда однородны. Данные об их строении были опубликованы почти одновременно двумя группами исследователей: Г. Шраммом с сотрудниками из Института Макса Планка в Тюбингене (ФРГ) и X. Л. Френкель-Конратом с сотрудниками из Лаборатории вирусов Калифорнийского университета. Обе группы независимо друг от друга установили, что каждая субъединица состоит из цепи аминокислот, объединенных пептидными связями в полипептиды. Но если немецкие ученые насчитали 157 молекул аминокислот в одной такой субъединице, то американские увидели на одну больше. И как показали более поздние исследования, вторая цифра оказалась правильной.
В каждой субъединице представлены 16 различных аминокислот. Их названия, сокращенные символы и количество молекул в субъединице приведены в таблице 6.
Субъединица белкового цилиндра вируса табачной мозаики образуется соединением 158 аминокислотных остатков, размещенных в определенном порядке.
Расположение аминокислот в субъединице, установленное сотрудниками Лаборатории вирусов, видно из приведенного рисунка.
На фото 44 представлена модель ВТМ с яйцевидными субъединицами белков и витками РНК, которые обозначены черным.
Основными субъединицами РНК являются нуклеотиды. Различают четыре типа этих соединений: адениловая, гуаниловая, цитидиловая и уридиловая кислоты. В целой спирали РНК насчитывается 6500 нуклеотидов, но их расположение еще неизвестно.
Вся молекула ВТМ состоит приблизительно из 5 250 000 атомов следующих биогенных элементов: углерода, водорода, кислорода, азота, фосфора и серы. Пять с четвертью миллионов атомов распределены между 6500 нуклеотидами в молекуле РНК и 2200 субъединицами белков, каждая из которых содержит 158 аминокислотных остатков. И несмотря на такую сложность состава и структуры, вирус табачной мозаики имеет длину, равную всего лишь трем десятитысячным, а ширину — 18 миллионным долям миллиметра.
Что представляла бы собой частица ВТМ при увеличении ее в миллион раз? Это был бы небольшой цилиндр длиной около 30 см и диаметром 1,5 см. Увеличенная еще в тысячу раз, она напоминала бы цилиндрическую башню диаметром 18 м и высотой 300 м. Если бы у этой башни было 2200 лестничных ступенек, то каждая из них соответствовала бы одной белковой субъединице ВТМ, причем высота ее равнялась бы 14 см и состояла бы она из 158 кирпичей шестнадцати различных типов. В этом случае каждый кирпич отвечал бы одной молекуле из 16 типов аминокислот, присутствующих в белковых субъединицах. При подъеме по такой винтовой лестнице на верхушку башни мы сделали бы 130 витков вокруг ее оси. И если бы к концу путешествия у нас не закружилась голова и мы смогли бы заглянуть в цилиндрическую шахту четырехметрового диаметра, находящуюся в центре башни, то увидели бы в ней 6500 многогранников, поставленных друг на друга по спирали. Эта спираль соответствовала бы спирали РНК вирусной частицы, состоящей из 6500 нуклеотидов. Многогранники были бы к тому же четырех типов, что отвечает четырем типам нуклеотидов, участвующих в структуре макромолекулы РНК.
Наконец, приведем еще одно сравнение: частица нашего вируса относилась бы к этой фантастической башне как 1 секунда к 32 годам!
Такой строгой симметрией, какую мы видели в архитектонике частицы ВТМ, отличаются и все прочие вирусы. Косвенным доказательством этого является и строение кристаллических вирусов, обнаруженное при помощи особого рентгеновского аппарата, который применяется для изучения строения молекул различных соединений. Эти данные успешно дополняются и непосредственным наблюдением вирусных частиц в электронном микроскопе при увеличении их в сотни тысяч раз. Для этой цели препараты вирусов обрабатываются фосфорно-вольфрамовой кислотой, не пропускающей электроны. Эта жидкость заполняет крошечные пространства между отдельными субъединицами вирусной частицы. При наблюдении в электронном микроскопе электроны проходят только сквозь «не-затененные» белковые цепи, образуя как бы подобие негативного изображения вирусных частиц. При этом можно убедиться в строго симметричном расположении субъединиц вируса.
Сходную с ВТМ спиральную структуру имеют и многие другие вирусы. Например, миксовирусы, составляющие группу возбудителей ряда болезней человека и животных (вирусы гриппа, свинки и др.). Правда, некоторые миксовирусы имеют еще более сложное, но всегда симметричное строение. Модель такого чрезвычайно сложного по строению вируса представлена на фото 45.
Частицы других вирусов напоминают своей формой многогранники, и вирусологи относят их к группе вирусов с икосаэдрической симметрией (икосаэдр — двадцатигранник, стенки которого представляют собой равносторонние треугольники). Частице аденовирусов, например, соответствует модель, состоящая из 252 шаровидных субъединиц (фото 45, в), частице вируса герпеса отвечает модель из 162 субъединиц. Самый мелкий из известных нам вирусов — бактериофаг ØX174, у которого только 12 поверхностных субъединиц.
Отдельная вирусная частица — это основная инфекционная единица данного вируса. Она состоит из белковой «оболочки» и скрытой в ней молекулы нуклеиновой кислоты. Мы уже говорили, что частицы вирусов отличаются от клеток еще и тем, что всегда содержат лишь один тип нуклеиновой кислоты. Частицы ВТМ, мы знаем, содержат РНК; эта же нуклеиновая кислота находится в частицах вируса гриппа и полиомиелита. Но в частицах упомянутого аденовируса имеются молекулы ДНК.
Обе нуклеиновые кислоты, ДНК и РНК, выполняют в каждой вирусной частице важные «дирижерские» функции, подобно тому как они делают это в клетках бактерий и других организмов.
Рассмотрение нами вопросов строго определенной геометрической структуры и симметрии в вирусах было бы неполным, если бы мы не рассказали, хотя бы вкратце, об их размерах. Одна активная инфекционная единица вируса называется вирионом. Вирионы различных типов вирусов отличаются не только строением, но и тем, какую именно кислоту они содержат — ДНК или РНК. Определяющим признаком служит и их величина (в случае вирусов мы охотнее употребили бы слово «малость», а не «величина»). Вирус табачной мозаики по своей длине находится на верхней границе возможных размеров вирусов, он достигает 300 нм, или трех десятитысячных долей миллиметра. К наименьшим вирусам относится вирус различных форм ящура, частицы которого имеют диаметр 24 нм, или двадцать четыре миллионные доли миллиметра.
Каждая живая клетка представляет собой микрокосмос, в котором нуклеиновая кислота выступает в качестве диктатора, обычно к нам благоволящего; но в случае рака она становится деспотом-садистом, а в вирусных частицах — узурпатором.
В первой главе читатель узнал о борьбе между приверженцами плеоморфистского и мономорфистского направлений в микробиологии конца XIX века. Эта борьба закончилась победой мономорфистов — сторонников учения о неизменности микробов. Однако победа эта была далеко не окончательной.
Уже в 20-е годы мономорфистская теория впервые подверглась сомнению. Стало известно явление так называемой диссоциации бактерий. При выращивании пневмококков, вызывающих воспаление легких (см. фото 57), было обнаружено, что их колонии на питательном агаре изменяют свой облик. Поначалу гладкие и блестящие (обозначим их состояние буквой «S», от английского smooth — гладкий), они становились через некоторое время шероховатыми и сморщенными по краям (обозначим их буквой «R», от английского rough — шероховатый).
Клетки из колоний R отличались от клеток из колоний S еще и тем, что были значительно менее вирулентными, иначе говоря, их способность вызывать заболевание стала значительно слабее. Следует отметить, что обратного превращения R-формы в S-форму никогда не наблюдалось. Этот переход S→R и получил название диссоциации (фото 46).
Следующее неожиданное открытие последовало через несколько лет, когда удалось осуществить изменение пневмококков в обратном направлении, из состояния R в S. Это изменение, протекающее в обратном направлении, в отличие от диссоциации получило название трансформации.
В 1944 году к вопросу трансформации вернулись вновь. Американские микробиологи К. Т. Эйвери, К. М. Маклеод и М. Маккарти доказали, что трансформацию вызывает содержащаяся в пневмококках дезоксирибонуклеиновая кислота! Это выглядело, однако, довольно смелым утверждением… И означало, что сама ДНК была передатчиком наследственных изменений.
Проблемой нуклеиновых кислот занимался еще в 1868 году швейцарский химик Ф. Мишер, открывший в клетках гноя особое вещество, названное им «нуклеином», поскольку оно встречалось исключительно в клеточном ядре (nucleus — ядро). Это была ДНК. Она находится в каждой из двух биллионов клеток человеческого организма и в клетках всех прочих организмов. Мы знаем также, что ДНК присутствует и в некоторых бактериофагах и вирусах. Спустя 30 лет в клетках дрожжей открыли другую нуклеиновую кислоту, ее мы теперь сокращенно обозначаем РНК.
Во всех клеточных ядрах организма (фото 47) количество ДНК всегда одинаково.
ДНК — длинная макромолекула, основными структурными элементами которой являются нуклеотиды. Каждый нуклеотид состоит из 29–35 атомов. Нуклеотид построен из трех структурных элементов: органического основания, углевода и фосфорной кислоты. Углевод, который в ДНК называется дезоксирибозой, и фосфорная кислота во всех нуклеотидах одинаковы; органических оснований в нуклеотидах несколько: аденин (А), тимин (Т), гуанин (Г) или цитозин (Ц).
РНК отличается от ДНК тремя основными особенностями: вместо дезоксирибозы содержит близкий к ней сахар — рибозу; вместо тимина (Т), присутствующего только в ДНК, — урацил (У), и наконец, в отличие от ДНК, являющейся двойной цепью, напоминает простую длинную цепь, в которой нуклеотиды расположены последовательно в ряд. До сих пор в этом отношении известно только единственное исключение — бактериофаг с шифром ØX174 имеет ДНК в виде простой, а не двойной цепи.
Простая цепь РНК состоит из чередующихся молекул рибозы и остатков фосфорной кислоты, причем к каждой молекуле рибозы перпендикулярно оси цепи присоединяется одно из четырех нуклеотидных оснований — У, Г, Ц или А. Часть молекулы РНК изображена в виде следующей схемы:
где Р означает рибозу, Ф — остаток фосфорной кислоты, У, Ц, А и Г — различные нуклеотидные основания.
Изучение структуры ДНК продолжалось долгие годы начиная с 20-х годов, когда о ДНК было известно примерно столько же, сколько мы сейчас рассказали.
В начале 50-х годов профессор Е. Чаргафф и его коллеги установили, что в молекуле ДНК определенно взаимосвязаны два спаренных основания, причем всегда аденин с тимином (А — Т), а гуанин с цитозином (Г — Ц). Количественные отношения между этими парами в молекуле ДНК одного и того же биологического вида всегда постоянны, но различаются у разных видов. Чем более родственны виды между собой, тем более сходны и количественные отношения этих пар в ДНК и наоборот, чем меньше родства между видами, тем эти отношения менее сходны.
Приблизительно в это же время американский биохимик Л. Полинг исследовал вместе со своим сотрудником Р. Кори структуру белка. Они установили, что полипептиды (ряды связанных в цепи аминокислот) образуют некоторое подобие спирали, так называемую α-спираль.
Вскоре после этого англичанин М. Уилкинс и другие исследователи доказали, что и макромолекулы ДНК имеют такую же спиральную структуру. Американец Дж. Уотсон и англичанин Ф. Крик на основании этих и других данных построили структурную модель молекулы ДНК. За эту, по существу, новаторскую работу Уотсон, Крик и Уилкинс были удостоены в 1962 году Нобелевской, премии по медицине и физиологии. Уотсон и Крик в своей модели наглядно изобразили структуру молекулы ДНК в виде двойной спирали. Внешние витки этой макромолекулы образуют цепи, в которых закономерно чередуются молекулы дезоксирибозы (Д) и фосфорной кислоты (Ф). Цепи как бы намотаны на внутренний «цилиндр», состоящий из спаренных оснований А — Т и Г — Ц. С наружной стороны основания присоединены к дезоксирибозе другой цепи. Между собой основания связаны водородными мостиками, известными по многим другим соединениям. Внутреннюю организацию молекулы ДНК можно изобразить следующей схемой:
Обе цепи обхватывают внутренний цилиндр так, что их витки всегда находятся на его противолежащих сторонах. Каждый поворот цепей на 360° размещает новые 10 пар нуклеотидов. Модели молекул ДНК с их двойными спиралями наглядно изображены на прилагаемом рисунке.
Количество нуклеотидов в ДНК возрастает с усложнением организмов. Бактериофаги содержат в своих молекулах ДНК около 5000—10 000 нуклеотидов, но у бактерий их уже около 5 000 000. Каждая клетка человеческого организма содержит до 800 000 молекул ДНК, и в каждой из них имеется около 40 000 нуклеотидов.
Мы уже упоминали, что ДНК как «трансформационный фактор» изменяет наследственные свойства пневмококков. Мир микробов представляет нам все больше свидетельств того, что ДНК является генетическим материалом клетки, управляющим тысячами происходящих в ней химических реакций. Эти реакции направлены на сохранение и размножение клеточных структур. Деятельность ДНК, таким образом, тесно связана с размножением и наследственностью.
Вопросами передачи наследственных свойств от поколения к поколению занимается генетика, давно установившая, что главным органом, «ответственным» за эту передачу, является клеточное ядро, хотя в последнее время стала известна немалая роль в этих процессах и самой цитоплазмы. Эта ответственность за передачу наследственных свойств сосредоточена в ядре, в образованиях, которые называются хромосомами (фиг. V и VI). Позднее генетики доказали, что носителями тех или иных характерных особенностей организма, передающихся из поколения в поколение, являются определенные участки хромосом, ген ы. С генами тесно связана и способность клетки осуществлять определенные химические реакции. Как же работают гены и какова их сущность? Долгое время для ученых это оставалось загадкой.
Модель двойной спирали ДНК. Внешние цепочка возникают соединением остатков дезоксирибозы (пятиугольники на правых схемах) с остатками фосфорной кислоты. «Мостики» между остатками дезоксирибозы образуются соединением двух пар А — T и Г — Ц.
В 40-х годах начался период «химизации» генетики. Два американских генетика, Дж. Бидл и Э. Тейтем, экспериментально показали, что возникновение и активность каждого фермента в клетке контролируется определенным геном; их теорию характеризует утверждение «один ген — один фермент». Это было еще одним шагом к познанию генов, которые в то время считали белками.
Через некоторое время пришло открытие химического состава «передаточного начала» бактерий, и генетики уточнили свое представление о генах. Их стали считать нуклеопротеидами, то есть сложными соединениями ДНК с белком.
В процессе митоза, когда клетка подготавливается к делению на две новые, с хромосомами происходят удивительные превращения. Каждая хромосома делится вдоль на две части, и обе части попадают в ядра двух новых, дочерних клеток. Таким образом, обе клетки получают поровну тот генетический материал, количество которого в материнской клетке перед митозом (в так называемой интерфазе) удвоилось. Но поскольку генетический материал содержит ДНК, очевидно, что и ее количество увеличилось в два раза. В настоящее время это уже достоверно доказано.
Но если ДНК является химическим носителем наследственности, как сейчас принято считать, то перед нами неизбежно встают новые вопросы. Как именно «закодированы» в молекуле ДНК эти наследственные особенности? Каким образом обеспечивается постоянство этого «кода» из поколения в поколение?
Авторы модели ДНК представляют систему «кодирования» следующим образом: различные свойства ДНК в разных организмах объясняются различием в составе нуклеотидов в ее молекуле. Нуклеотиды, по их мнению, являются своего рода генетическим алфавитом, при помощи которого в ДНК «химическим почерком» закодированы наследственные особенности организма. А поскольку ДНК содержит по меньшей мере несколько тысяч нуклеотидов, возникают неограниченные возможности комбинаций во взаимном чередовании и порядке пар А — Т, Г — Ц в ее молекуле. Каждая новая комбинация придает новые свойства ДНК.
Молекулы ДНК в клетке, поясняют далее Дж. Уотсон и Ф. Крик, способны к «самовоспроизведению» (редупликации) с сохранением постоянного расположения нуклеотидов. Мы знаем, что внутренний «цилиндр» молекулы ДНК состоит из пар оснований А — Т и Г — Ц, соединенных между собой водородными связями. Редупликация молекул ДНК может идти следующим образом. Водородные связи между парными нуклеотидами на одном конце молекулы постепенно начинают прерываться и обе спиральные цепи ДНК «разматываются», освобождаясь друг от друга. Такая развернувшаяся цепь удерживается связями между остатками молекул дезоксирибозы и фосфорной кислоты, «выставив» перпендикулярно оси свои основания. В окружающей среде находятся синтезированные клеткой свободные нуклеотиды, которые могут входить в реакцию со свободными основаниями развернутой цепи ДНК. Но к каждому основанию может приблизиться и соединиться с ним только нуклеотид, имеющий парное, «дополняющее» основание. Это значит, что к развернутой цепи начнет присоединяться другая, недостающая цепь ДНК, причем точно такая, какая была в другой половине макромолекулы и отделилась, чтобы подобным же образом извлечь из среды то, чего ей недостает до полной молекулы ДНК. В результате этих процессов образуются две молекулы ДНК, каждая из которых имеет половину материнской молекулы, дополненную вновь синтезированной. Дочерние молекулы становятся, таким образом, точной копией материнской ДНК. При этом сохраняется и состав генетического материала.
Здесь мы должны, однако, предупредить читателя, что то, о чем он только что прочел, было всего-навсего гипотезой Уотсона и Крика о редупликации ДНК. Вы можете справедливо заметить, что правильность гипотез должна быть доказана экспериментально.
Описанную гипотезу подтвердил американский биохимик А. Корнберг, которому удалось открыть полимеразу ДНК — фермент, участвующий в процессе редупликации. Получив из клеток кишечных бактерий Escherichia coli ДНК и фермент, он соединил их в пробирке, добавив туда же смесь соответствующих нуклеотидов. Через некоторое время количество ДНК в пробирке значительно увеличилось, причем были использованы присутствующие в среде свободные Нуклеотиды. За свое открытие он получил в 1959 году Нобелевскую премию по физиологии и медицине. Эту премию разделил с ним профессор С. Очоа, открывший независимо от Корнберга фермент — полимеразу РНК, которая синтезирует рибонуклеиновую кислоту. Совсем недавно Корнберг обнаружил еще один фермент, участвующий в синтезе ДНК, и назвал его фосфатазой ДНК.
Модель редупликации молекулы ДНК. К развернутым цепочкам (вверху) присоединяются дополнительные цепочки того же состава, что и в материнской молекуле.
Гипотезу о редупликации ДНК подтвердили в 1958 году М. С. Месельсон и Ф. Сталь. Они культивировали бактерии Е. coli в жидкой питательной среде, содержащей вещества с радиоактивным азотом 15N. ДНК этих бактерий оказалась потом «меченной» радиоактивным элементом всюду, где в ее макромолекулах содержится атом азота. Затем ученые культивировали бактерии в жидкой питательной среде, содержащей нерадиоактивный азот 14N. При выращивании бактерии размножались, и можно было наблюдать, как радиоактивный азот ДНК равномерно распределялся по дочерним молекулам ДНК. В каждой последующей генерации бактерий отмечалась половинная радиоактивность ДНК по сравнению с предыдущей. Иначе говоря, при каждой редупликации ДНК радиоактивность материнской макромолекулы равномерно распределялась в двух дочерних макромолекулах, которые создавали недостающие им цепи, привлекая для этого нуклеотиды с нормальным азотом.
Итак, по мнению Крика и его коллег, ДНК можно считать химическим носителем наследственности, иначе говоря, ДНК — это определяющая составная часть генов. Бидл и Тейтем уже давно сформулировали положение «один ген — один фермент», согласно которому гены определяют синтез и состав ферментов. Если ДНК действительно является генетической молекулой, она должна определять и строение того или иного фермента. Эту определяющую роль ДНК по Уотсону и Крику можно объяснить порядком распределения нуклеотидов в ее молекуле, то есть последовательностью, в которой чередуются в цепях ДНК четыре возможных нуклеотида. Но поскольку ферменты в химическом отношении являются молекулами белков, а структурными элементами последних — аминокислоты, то порядок расположения аминокислот в молекуле белка (а значит, и ферментов) будет определяться расположением нуклеотидов в молекуле ДНК, точнее — расположением нуклеотидов в цепях молекулы ДНК.
Допустим, что так оно в действительности и есть. Тогда возникает вопрос: как же все это происходит? Каким образом тройки нуклеотидов в ДНК определяют синтез белков, в том числе и ферментов?
1961 год войдет в историю не только как год начала космической эры. Он был отмечен также событием, которое приблизило нас к решению важнейшего биологического вопроса — о механизме синтеза белка. В 1961 году сотрудники Пастеровского института Ф. Жакоб и Ж. Моно опубликовали статью, в которой они попытались объяснить интересующее нас явление. Эти ученые, получившие спустя четыре года Нобелевскую премию по медицине и физиологии, предложили гипотезу, согласно которой ДНК управляет синтезом белков не непосредственно. Роль посредника выполняет особая молекула РНК, структура которой представляет собой как бы отпечаток структуры ДНК. Эта особая молекула РНК образуется при раскручивании двойной спирали молекулы ДНК так, что на развернутой цепи ДНК возникает цепь РНК с таким расположением нуклеотидов, которое соответствует расположению последних в цепи ДНК. Обозначим нуклеотиды заглавными буквами названий их органических оснований. На раскрученной спирали ДНК с нижеприведенным порядком нуклеотидов должна возникнуть цепь РНК с соответствующим «парным» и дополняющим расположением нуклеотидов, а именно цепи ДНК
(А — Г — Т) — (Т — Ц — А) — (Т — Т — Т) — (Г — А — А)
отвечает цепь РНК
(У — Ц — А) — (А — Г — У) — (А — А — А) — (Ц — У — У)
После своего образования цепь РНК отделяется от цепи ДНК и перемещается в то место клетки, где происходит синтез ферментов. РНК в приведенной нами схеме содержит четыре тройки нуклеотидов и, если исходить из гипотезы Жакоба и Моно, определяет порядок четырех аминокислот в будущей молекуле белка. Макромолекула белка требует значительно более ёмкой информации, заключенной в молекуле РНК, которая должна содержать столько троек нуклеотидов, сколько молекул аминокислот должно присоединиться к макромолекуле белка.
Поскольку генетическая информация химически «переписывается» с ДНК на молекулу РНК, которая понесет далее «послание», или информацию о синтезе молекулы белка, мы назовем эту РНК, переносчика информации, информационной РНК, или иРНК[22].
Естественно, что подобное представление, будучи лишь гипотетическим, требовало экспериментального подтверждения. Проверка его началась в США в том же 1961 году. Американский биохимик М. Ниренберг из Линговского национального института сердца поставил смелый эксперимент. Специальными методами он разрушил клетки бактерий Escherichia coli и получил бесклеточную массу, способную синтезировать белки. Затем заменил предполагаемую Жакобом и Моно иРНК искусственной, которая на языке химиков называлась полиуридиловой кислотой (сокращенно поли-У) и содержала вместо четырех типов нуклеотидов, обычных для природной иРНК (А, У, Ц, Г), только один — уридиловую кислоту (У). Поли-У образует цепь РНК в таком виде:… У — У — У — У — У — У —… Внесение поли-У в бесклеточную массу не дало каких-либо существенных результатов: из 20 различных аминокислот в состав белков включились молекулы одной-единственной аминокислоты — фенилаланина. Из этой единственной аминокислоты образовались только макромолекулы белков, или поли-фенилаланинов. В соответствии с «нуклеотидными тройками» (триплетами) и поли-У образует цепь триплетов У — У — У, являющихся «кодоном» для включения молекул фенилаланина в белки.
Вскоре после проведения этих исследований из лаборатории Ниренберга поступили новые сообщения: для образования фенилаланина необходима еще одна клеточная РНК, которая должна будет переносить иРНК. Для каждой аминокислоты клетка должна иметь особый тип такой транспортной РНК (тРНК).
Еще в 1957 году Р. Холли из Корнельского университета, опубликовал сообщение о существовании тРНК. К 1961 году уже стало известно, что в клетках существуют различные типы тРНК, которые в присутствии соответствующих ферментов соединяются с определенными аминокислотами. Предполагали, что в виде такого промежуточного соединения с тРНК аминокислоты перемещаются к месту синтеза белков. В 1965 году Холли опубликовал результаты своих многолетних исследований: установил расположение нуклеотидов в молекуле тРНК, специализировавшейся на переносе аланина.
Но где же в клетке происходит синтез белков? Мы познакомились с тремя элементами, необходимыми для «производства» белковых молекул: аминокислоты, иРНК, тРНК. Сам же процесс сборки макромолекул белка протекает в особых цитоплазматических образованиях, называемых рибосомами.
В упрощенном виде синтез белковой молекулы можно представить следующим образом. К длинной цепи иРНК подходят рибосомы (видимые лишь в электронный микроскоп). К этому комплексу присоединяются частицы тРНК, связанные с молекулами аминокислот. Триплетам нуклеотидов в цепочке иРНК (так называемым кодонам) соответствуют дополняющие триплеты нуклеотидов на каждой молекуле тРНК (антикодоны). Расположение кодонов в цепочке иРНК определяет, в каком именно порядке присоединятся к ним антикодоны РНК. Это означает, что аминокислоты, отвечающие специфическим тРНК, перемещаются к рибосомам в определенном порядке. В точно таком же порядке будут присоединяться к зарождающейся макромолекуле и белки. Весь этот сложный процесс поможет нам понять приведенная ниже схема. Но прежде мы должны представить читателю одного ученого, деятельность которого будет иметь в нашем рассказе немаловажное значение.
Речь идет о X. Коране, индийском исследователе, проживающем в США. Вместе со своими сотрудниками из Висконсинского университета Корана попытался решить две задачи: во-первых, синтезировать по образцу иРНК искусственные полимеры, которые содержали бы соответствующие кодоны для отдельных аминокислот; во-вторых, синтезировать искусственные полимеры по образцу ДНК с таким расположением нуклеотидов, которое отвечало бы соответствующим кодонам в иРНК, и проверить их активность.
Первая задача была нелегкой. Группе Кораны предстояло получить все 64 возможных типа кодонов, необходимых для проверки «кодирования» порядка 20 аминокислот белков. Однако им удалось все же найти решение. Данные о кодонах они получили иным путем, отличным от того, каким шла группа Ниренберга, и дополнили их недостающими данными для остальных аминокислот.
Вторая задача оказалась еще труднее. Если в первой исследователи стремились получить синтетические полирибонуклеотиды, то во второй им необходимо было попытаться синтезировать полидезоксирибонуклеотиды. Эти «искусственные молекулы ДНК» они должны были использовать затем в управляемом синтезе «искусственных молекул РНК» с соответствующими кодонами. Ценную помощь им оказал в этом деле фермент, открытый в лаборатории профессора Очоа. Старания Кораны и его коллег увенчались успехом.
Ниренберг — Холли — Корана, этот биохимико-генетический «триплет» ученых, экспериментально подтвердили правильность представлений Уотсона и Крика о триплетах нуклеотидов в ДНК. Они подтвердили и гипотезу Жакоба и Моно об управляемом синтезе информационных РНК, выяснили роль транспортных РНК и их антикодонов при определении положения аминокислот в возникающих на рибосомах белковых молекулах. И не удивительно, что в декабре 1968 года все трое — Ниренберг, Холли и Корана — за эту свою работу получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине.
Как уже было сказано, Корана успешно решил и вторую из поставленных задач. В июне 1970 года на встрече биохимиков и молекулярных биологов в его родном университете на вопрос, чем ученый занят сейчас, после получения Нобелевской премии, Корана ответил, что ему наконец удалось получить ген в пробирке! Его лаборатория занималась синтезом гена целых пять лет.
Мы знаем, что другой нобелевский лауреат, Холли, раскрыл тайну расположения нуклеотидов в транспортной РНК, служащей для переноса аланина. На основании данных о расположении нуклеотидов в тРНК Корана набросал на бумаге схему структуры гена (или ДНК), который «отвечает» за синтез данной тРНК. Этот набросок позволил ему через пять лет получить первый «синтетический» ген: он состоял из 77 пар нуклеотидов, расположенных в такой последовательности, при которой ДНК определяет синтез аланиновой тРНК.
После этого группа Кораны приступила к экспериментам по «размножению» молекул синтезированного гена при помощи ферментов Корнберга, вызывающих редупликацию молекул ДНК, о которой мы уже говорили; надо было испытать активную способность «гена в пробирке», который должен управлять синтезом аланиновой тРНК. А за этим последовали опыты, имеющие целью подтвердить биологическую активность «синтетического» гена и в живой клетке. Ведь существовать ему предстояло именно в ней! Пятилетняя напряженная работа группы Кораны в конце концов успешно увенчалась синтезом некоего вещества, которое в природе, в живых клетках, несомненно, существует.
Но вернемся к нашей схеме. Она дает упрощенное представление о том, какое расположение трех триплетов нуклеотидов в молекуле ДНК определяет окончательный порядок трех аминокислот в образующейся на рибосомах молекуле белка.
Триплеты в молекуле ДНК:
… — (А — А — А) — (Г — А — Г) — (Т — Т — Т) —…
Дополняющие кодоны в молекуле иРНК:
… — (У — У — У) — (Ц — У — Ц) — (А — А — А) —…
Антикодоны в трех молекулах тРНК:
(А — А — А) (Г — А — Г) (У — У — У).
Расположение трех аминокислот во фрагменте молекулы белка:
… — Фен — Лей — Лиз —…
Приведенные триплеты молекулы ДНК можно считать частью «генетической информации», заложенной в гене, управляющем синтезом определенного белка. В макромолекуле этого белка на соответствующем месте будет находиться тройка аминокислот: фенилаланин — лейцин — лизин.
Согласно изложенному представлению, в клетке существует, таким образом, следующая иерархия макромолекул:
ДНК → РНК → Белок.
В 1970 году стали появляться сообщения о том, что при некоторых обстоятельствах, например при инфицировании клетки вирусами, имеющими в своем составе РНК, а не ДНК, генетический код для синтеза белков «записан» в молекуле РНК. Эти вирусные РНК в клетке-хозяине «самовоспроизводятся» и управляют синтезом ДНК, необходимой для образования вирусных белков. Таким образом, мы столкнулись с тем, что генетическая информация может быть перенесена от РНК к ДНК.
В других случаях оказался возможным и прямой перенос генетической информации с ДНК на белок без посредничества РНК.
Все эти сведения вызвали широкую полемику в ученых кругах. Обсуждался вопрос — остается ли в силе центральная догма молекулярной биологии[23]. Итог дискуссии подвел один из «отцов» этой догмы, Ф. Крик, который охарактеризовал уровень современных знаний в данной области следующим образом.
Существуют общие и специальные переносы генетической информации. Общие переносы можно сформулировать в такой последовательности:
ДНК → ДНК
ДНК → РНК
РНК → Белок
Специальные переносы информации, совершающиеся лишь в особых случаях, могут выглядеть и так:
РНК → РНК
РНК → ДНК
ДНК → Белок
Все это хорошо видно на рисунке ниже, где общие переносы и их направление показаны сплошной линией, а специальные — штриховой.
Но открытия 1970 года на этом не закончились. Самые волнующие события этого года связаны с изучением и поиском онкогенных вирусов — вирусов, вызывающих некоторые формы опухолей.
Перенос генетической информации. Сплошные стрелки — общий перенос; штриховые — специфический.
На Международном онкологическом конгрессе в мае 1970 года в Хьюстоне доктор X. Темин из Висконсинского университета сообщил об открытии фермента, способного синтезировать ДНК в присутствии РНК. И этот фермент и РНК находятся в вирусе Рауса, известном уже в течение нескольких десятилетий как возбудитель саркомы. Открытие Темина в скором времени подтвердил его соотечественник Д. Балтимор. Другой американский ученый, С. Спигелмен, сообщил в конце июня 1970 года, что тот же фермент обнаружен им в семи различных онкогенных вирусах. Летом того же года на Международном конгрессе микробиологов в Мексике Спигелмен сообщает о новом неожиданном факте. Оказывается, онкогенные вирусы содержат еще один фермент — «полимеразу ДНК», связанную с ДНК и ранее известную как «полимераза ДНК Корнберга».
Но эстафету снова перехватывает Темин, открывший третий фермент в вирусе саркомы Рауса: эндонуклеазу, «рассекающую» длинную двойную спираль ДНК на короткие отрезки. Возможно, есть и четвертый фермент — лигаза, осуществляющая соединение этих фрагментов снова в длинную макромолекулу ДНК»
В ноябре 1970 года в Париже на Международном коллоквиуме, который проводился фирмой, занимающейся производством антибиотиков, американский ученый X. Ханафуза сообщил общественности, что обе полимеразы вируса Рауса играют важную роль в превращении здоровых клеток в опухолевые. Другие участники коллоквиума сообщили, что из белых кровяных телец людей, пораженных белокровием, была выделена полимераза ДНК, связанная с РНК. Таким образом, фермент, присутствующий в онкогенных вирусах, был найден и в белых кровяных тельцах больных лейкозом. Спигелмен сообщил, что этот фермент был им обнаружен в девяти случаях лейкоза и ни разу не был найден в нормальных здоровых лейкоцитах. Это означало, что обнаружение фермента в белых кровяных тельцах могло бы служить ранним диагностическим признаком лейкоза.
Р. Галло из Национального онкологического института в Бетесде (США) получил тот же фермент из лимфоцитов трех пациентов, страдающих лимфоцитарным лейкозом. Исследовав действие некоторых соединений на этот фермент, он установил, что антибиотик рифампицин снижает активность фермента (в лабораторных условиях, в пробирке) на 50 %. А один из производных рифампицина — диметилрифампицин — полностью «блокирует» действие фермента.
Конечно, еще рано праздновать победу над лейкозом. Но одно несомненно: успехи молекулярной биологии в этом направлении могут привести к важным практическим результатам.
Та форма «состязания», которая наблюдается сейчас в среде ученых, должна была бы, как нам кажется, превратиться в сотрудничество. Прав Спигелмен, который сказал, что следовало бы больше думать о защите страдающих от белокровия детей, чем о времяпрепровождении ученых в Стокгольме после получения ими Нобелевской премии.
Таково было в общих чертах положение дел к концу 1970 года. Но наука не стоит на месте. В конце января 1971 года в Лондоне состоялся симпозиум, регулярно созываемый Международной организацией ЦИБА. На симпозиуме опять выступил Спигелмен и опять с неожиданными сообщениями.
Он доложил о результатах исследований нескольких сотен образцов клеток из различных форм раковых образований у человека; в каждом из них присутствовала полимераза ДНК, связанная с РНК. В здоровых клетках взрослых людей фермент не был найден ни в одном случае. Работы Спигелмена и его коллег доказал и, что при помощи фермента можно не только диагностировать лейкоз, но и следить за процессом лечения и выздоровления.
Второе сообщение имело еще более важное значение. Спигелмен получил этот фермент в чистом виде из РНК онкогенных вирусов, ему удалось также получить фермент и из клеток больных раком. Но эти два фермента оказались различными! Значит, фермент, найденный в раковых клетках человека, не вирусного происхождения, как считали ранее.
Однако на самую большую неожиданность Спигелмен наткнулся перед публикацией своих последних наблюдений. Стремясь исследовать некоторые другие нормальные клетки, чтобы установить, не присутствует ли все-таки в них этот загадочный фермент, он исследовал ткани человеческого плода (выкидыша). Результат был подобен разорвавшейся бомбе — клетки эмбриона содержали тот же фермент! Действительно, неожиданный поворот событий! Удивительные ферменты, которые, как полагали, проникают в тело человека с вирусными частицами и имеют какую-то связь с раком, вдруг обнаружены в зародыше человека.
Какие же выводы можно сделать из этих фактов? Конечно, мы не должны забывать, что существуют различные, очевидно специализированные, типы полимеразы ДНК. Во всяком случае, присутствие фермента в раковых клетках человека и в клетках человеческого зародыша едва ли стоит связывать с вирусами. Вполне возможно, что в наборе человеческой клетки есть и такие гены, которые несут в себе «генетическую информацию» для синтеза этого фермента. Быть может, в нем нуждается каждая клетка, которой предстоит быстрый рост и размножение, а такими клетками как раз и являются клетки плода и опухолевые клетки.
Первое предсказание об информационных РНК оказалось справедливым. Но Жакоб и Моно высказали еще одно предположение, которое также понемногу подтверждается. Согласно изложенному представлению, структура ферментов закодирована в молекулах ДНК. Но бактериальная клетка и в синтезе ферментов должна «поступать рационально». X. Э. Умбаргер со своими сотрудниками показал, что бактерии способны прекращать синтез ферментов, необходимых для образования той или иной аминокислоты, когда ее количество достигнет определенного уровня.
Жакоба и Моно заинтересовало, однако, другое явление. Бактерии Escherichia coll обладают многими любопытными свойствами. Так, они способны использовать молочный сахар — лактозу. Но для его потребления им необходимо три фермента. Назовем их А, Б и В. Было установлено, что эти ферменты вырабатываются только тогда, когда в питательной среде находится лактоза. Если заменить ее другим видом сахара, например глюкозой, ферменты А, Б и В в клетках не образуются. Но стоит нам перенести их в среду, содержащую лактозу, и через какую-то минуту в нашем распоряжении будут все три фермента.
Регулирующее действие оперона лактозы. Регулирующий ген i определяет с помощью иРНК возникновение репрессора, который связывается с оператором о и препятствует образованию ферментов (слева). В присутствии индуктора репрессор отделяется от оператора, в результате чего становится возможным образование ферментов. Промотор р необходим, чтобы дать импульс к синтезу иРНК. управляющих образованием ферментов (справа)
Этот интересный факт Жакоб и Моно попытались объяснить существованием «репрессора». Что же такое репрессор? По представлению этих ученых, основную роль в синтезе ферментов А, Б и В играют пять взаимосвязанных генов. Первый из них, регулятор, содержит в себе «рецепт» синтеза сравнительно простого соединения — репрессора. На других участках хромосомы размещаются остальные четыре гена, функционирующие как «опероны». Один из этих генов называется оператором, остальные — структурные гены А, Б и В, в которых находятся «рецепты» изготовления ферментов А, Б и В. Их деятельность, однако, контролирует оператор, выступающий в качестве «заведующего производством». Когда оператор свободен, структурные гены могут работать; иначе говоря, на цепочках их ДНК может осуществляться синтез трех соответствующих иРНК, которые передают «рецепт» получения трех ферментов рибосомам. Если же оператор занят, структурные гены не могут работать, оперон (как целое) бездействует и ферменты не вырабатываются. Регулирование активности оператора обеспечивает молекула репрессора. Если лактозы нет в среде, репрессор присоединяется к оператору и производство трех ферментов прекращается. Как только в среде появляются первые молекулы лактозы, положение меняется. Молекулы лактозы присоединяются к репрессору и изменяют его так, что он отделяется от оператора. Освобожденный оператор «дает импульс» к выработке ферментов, и структурные гены при посредничестве трех иРНК контролируют этот процесс. Полученные ферменты А, Б и В начинают свою деятельность и изменяют имеющуюся лактозу. Наконец молекул лактозы остается так мало, что они не в состоянии блокировать действия репрессора, молекулы которого возвращаются на свое прежнее место к оператору. Цикл, таким образом, замыкается. С присоединением репрессора к оператору дальнейшее образование ферментов А, Б и В становится невозможным, в них отпадает надобность, так как лактозы в среде уже нет.
Первые результаты проверки гипотезы Жакоба и Моно были получены в США. Двое ученых, У. Джилберт и Б. Мюллер-Хилл, еще в 1966 году доказали существование репрессора лактозы, который удалось выделить из бактерий. Оператором была ДНК, репрессором — белок. Годом позже М. Пташне из Гарвардского университета открыл еще один репрессор, связанный с ДНК бактериофага к и блокирующий передачу генетического кода соответствующей РНК. А в 1968 году группа ученых из Рокфеллеровского университета показала, что у бактериофагов с ДНК, замененной на РНК, функцию репрессора может выполнять белковый «футляр» вируса. В 1970 году ученому миру стало известно, что Дж. Бекуитс из Гарвардского университета выделил из бактерий оперон лактозы. Фотографии, сделанные при помощи электронного микроскопа, должны были убедить всех сомневающихся в реальности полученных данных. Мало того, через некоторое время из другой лаборатории пришла новая волнующая весть: выделенный из бактерий оперон лактозы управляет синтезом и в искусственных условиях, если только присутствуют аминокислоты и весь «производственный аппарат» для синтеза белков.
Г. Р. Стент, профессор молекулярной биологии Калифорнийского университета, справедливо писал, что единственное теоретическое продолжение открытия Уотсона и Крика состояло в догадке Жакоба и Моно об информационной РНК и опероне. Правильность обоих предположений постепенно подтверждается.
Хромосома, или ДНК, бактерии Escherichia coli содержит 2000 генов. Она несет в себе информацию о синтезе 2000 различных белков, каждый из которых имеет до 500 аминокислотных остатков.
Вернемся еще раз к явлению трансформации, с которой мы уже познакомились в предыдущей главе. Мы видели, что колонии пневмококков подвержены диссоциации, которая проявляется в изменении их свойств. Клетки пневмококков формы S очень вирулентны (вызывают типичную форму воспаления легких). Они образуют слизистые капсулы, которые обычно прикрывают пары клеток. Эти капсулы состоят из сложного полисахарида. Напротив, пневмококки формы R, образовавшиеся в результате диссоциации формы S, не вирулентны, не образуют капсул и не располагаются парами. Эти различия проявляются во время опытов на животных (определение вирулентности), микроскопирования (по присутствию парнорасположенных клеток с капсулами) и культивирования на питательной среде — агаре (по форме и цвету колоний).
Пневмококки доставили ранее много беспокойств медикам, поскольку врачи еще не располагали пенициллином и другими современными средствами борьбы с воспалением легких. В 1928 году английский бактериолог Ф. Гриффит открыл явление трансформации у этих микроорганизмов. Гриффит испытывал влияние невирулентных R-пневмококков на подопытных мышей. Он привил им миллионы клеток типа R, и мыши погибли. Исследуя органы погибших мышей в поисках этих бактерий, ученый столкнулся с неожиданным фактом: вместо лишенных капсулы пневмококков типа R там были исключительно имевшие капсулы вирулентные пневмококки типа S.
Гриффит предположил, что часть клеток, погибая, выделяет какое-то вещество, которое заставляет оставшиеся в живых клетки R образовывать капсулы. Это предположение он решил проверить следующими опытами. В организм мыши вносилось небольшое количество R-клеток вместе с многочисленными, но умерщвленными высокой температурой S-клетками. Клетки S принадлежали к так называемому типу I. Позднее, как и ожидал Гриффит, из мышей были выделены живые S-клетки. Во втором опыте он использовал живые R-клетки типа I и умерщвленные S-клетки типа II. В этом случае он получил из мышей живые S-клетки типа II. Напрашивалось единственно возможное объяснение: нечто из умерщвленных S-клеток типа II превратило (трансформировало) их родственников — лишенные капсулы R-клетки типа I — в вирулентные S-клетки, способные образовывать капсулы типа II. Чем же было это «нечто», что вызвало трансформацию? Гриффит назвал его трансформирующим началом.
Схема трансформации пневмококков R-формы в S-форму при помощи ДНК, выделенной из клеток S и перенесенной к клеткам R
Это «нечто», обладающее способностью активного действия, привлекло внимание исследователей, и не удивительно, что К. Т. Эйвери со своими коллегами из Рокфеллеровского университета попытался вскрыть его сущность. В 1944 году ученые с достоверностью доказали, что трансформирующим началом была ДНК из S-клеток. Читателю, уже немало узнавшему о генетической роли ДНК, такой результат представляется довольно очевидным. Но те, кто впервые с ним столкнулся, были в менее выгодном положении.
Первой задачей исследователей было вырастить достаточное количество клеток вирулентных пневмококков, чтобы получить из них трансформирующее начало. После их умерщвления и разрушения при помощи дезоксихолата натрия (вещества, содержащегося в желчи) они получили около 1 мг чистой ДНК из 30 миллиардов клеток. Если воздействовать этим веществом на R-клетки, то в их потомстве 1 % клеток начинает образовывать капсулы, и это свойство наследственно передается из поколения в поколение. Трансформация, таким образом, вызывалась при помощи ДНК из вирулентных пневмококков. Это позволило исследователям сделать вывод, что ДНК является трансформирующим началом.
Последовали подтверждения из многих микробиологических лабораторий мира, где также удалось провести трансформацию бактерий, но уже других, в частности кишечной палочки Escherichia coli. Трансформирующим началом во всех случаях была ДНК.
Однако, пневмококки в этом отношении занимали, как оказалось, особое положение, поскольку у них удалось трансформировать более 25 наследственных признаков, среди которых была способность к образованию капсул из полисахаридов, а также к созданию особых типов колоний и устойчивость к лекарственным препаратам. При трансформации обычно переносится лишь один из наследуемых признаков даже в том случае, если используется ДНК из пневмококков, обладающих двумя или тремя отличительными признаками. Если, например, на 1 000 000 клеток пневмококка формы R действовать десятимиллионной частью грамма ДНК из пневмококка формы S, устойчивой к пенициллину и стрептомицину, то трансформируется лишь 50 000 клеток. Из них приблизительно 49 000 получат одно из переносимых свойств (способность образовывать капсулы или устойчивость к определенному лекарству), около 800 клеток приобретут два новых свойства и только 4 клетки получат все три новых признака: способность к образованию капсул, устойчивость к пенициллину и устойчивость к стрептомицину.
ДНК при трансформации нередко передает и такие свойства, которые долгое время могут оставаться скрытыми и проявляются лишь при особых обстоятельствах. Так, например, трансформацией объясняется передача способности к созданию фермента, вызывающего окисление маннита (вещества, близкого к сахару маннозе). Этот фермент проявится только в том случае, если мы будем выращивать пневмококки на питательной среде, где единственным источником углерода будет маннит. Трансформированные пневмококки начнут окислять маннит и использовать его как источник углерода и энергии, тогда как их нетрансформированная «родня» в этой среде не будет расти и размножаться.
Интересно, что однажды трансформированные бактерии не теряют в дальнейшем способности к новой трансформации, особенно к такой, которая совершается с помощью ДНК, обладающей многими закодированными свойствами.
Читатель познакомится также и с такими важными проблемами, какой является, например, в наше время — в эру антибиотиков — устойчивость некоторых болезнетворных микробов к антибиотикам. Если, например, стафилококки стали устойчивыми к пенициллину, то лечение им инфекционных заболеваний, вызванных этими стафилококками, окажется бесполезным. Американский естественнонаучный журнал Science опубликовал в 1962 году сообщение о том, что ДНК, содержащаяся в восприимчивых к пенициллину стафилококках, может трансформировать устойчивые к нему стафилококки в чувствительные. К сожалению, такую трансформацию трудно осуществить в большом масштабе, иначе мы смогли бы трансформировать устойчивых представителей стафилококков в чувствительные и затем уничтожить их пенициллином!
Мы уже познакомились со строением вирусов. Узнали мы и об их сходстве с неживыми химическими соединениями. Теперь нам предстоит подробнее рассмотреть особенности, связывающие их с живыми организмами.
Итак, мы уже знаем, что вирусы сходны с последними прежде всего способностью размножаться. Однако их размножение происходит лишь в живых клетках хозяина. Сведения о том, как вирус проникает в клетку и как производит в ней разрушительные изменения, впервые были получены при наблюдениях над бактериофагами — врагами кишечной бактерии Escherichia coli. Электронный микроскоп помог нам раскрыть тайну внешнего строения бактериофага Т4, изображенного на фото 49. Ниже дана схема строения фага Т2. Частица фага имеет головку, напоминающую шестигранную призму с шестигранными же крышечками с обеих сторон. От головки отходит продолговатый хвостовой придаток, конец которого снабжен несколькими нитевидными «щупальцами». В придатке имеется канал, который соединяет его с головкой и в котором находится макромолекула ДНК. Остальные части оболочки фага — белковой природы.
Модель бактериофага Т2 — паразита-бактерии Escherichia coli. Граненая головка соединена с хвостовым придатком, имеющим внутренний канал и выросты для прикрепления к бактерии. На модели хвостовой придаток сжался и из него выдвинулась трубка с каналом, по которому ДНК проникает в бактерию.
Бактериофаг Т2 не имеет, по существу, двигательных органов и в жидкой среде перемещается пассивно, в результате столкновения с молекулами среды. Таким образом, он приходит в соприкосновение и с бактерией. Фаг «пристает» к ее поверхности при помощи щупалец. В конце хвостового придатка содержится фермент, поражающий оболочку бактерии и «проедающий» в ней небольшое отверстие. После этой операции придаток втягивается (укорачиваясь подобно гармонике) в тело фага.
ДНК из головки бактериофага через канал в хвостовом придатке и через образованное отверстие в стенке бактерии проникает в клетку. Все это несколько напоминает процедуру инъекции при помощи шприца. Белковая оболочка головки и придатка остаются снаружи, а в клетку бактерии входит только ДНК. И начинается драматическая фаза — «саморазмножение» ДНК фага. Макромолекула ДНК «принуждает» бактерию участвовать в процессе своего размножения, используя ее «сырье» и весь ферментный аппарат.
Как мы уже знаем, молекула ДНК образует подобие двойной спирали, состоящей из двух свернутых цепочек. При ее размножении эти цепочки, развертываясь, освобождаются друг от друга и к каждой из них присоединяются из среды основные структурные единицы (нуклеотиды), дополняя недостающую половину молекулы. Из первичной макромолекулы ДНК возникают две дочерние, а со временем их раскрученные цепочки дополняются новыми нуклеотидами. В результате появляются уже 4 макромолекулы, и вскоре число их возрастает до 8, 16 и т. д. По прошествии получаса из одной первичной молекулы ДНК фага в клетке находятся уже 150–300 ее потомков, принуждающих бактерию синтезировать белок для головки и хвостового придатка бактериофага. Клетка лопается, как воздушный шарик, выпуская в среду 150–300 бактериофагов, и те стремительно нападают на следующие бактерии. Процесс повторяется, и еще через полчаса в среде уже десятки тысяч фагов. Спустя некоторое время там не остается ни одной живой бактерии, кишат лишь победившие бактериофаги.
Весь этот процесс уничтожения бактерий и размножения фагов можно наблюдать под электронным микроскопом (фото 50). Впрочем, результаты такого уничтожения можно увидеть и невооруженным глазом. С этой целью в чашку Петри с агаризованной питательной средой наносят несколько капель культуральной жидкости, содержащей бактерии. Внесем туда же несколько капелек из другой жидкой среды, в которой находятся бактериофаги. Перемешаем их и равномерно нанесем несколько капель этой смеси на поверхность агара. Затем чашку Петри поместим в термостат при температуре 37 °C. Через 24 часа мы обнаружим следующую картину.
Несколько сотен бактериофагов, помещенных на поверхность агара, уже вошли в контакт с клетками бактерий и сделали свое дело. Там же находятся и клетки, избежавшие нападения фагов и продолжающие нормально размножаться. На поверхности питательной среды образуется видимый невооруженным глазом налет, местами прерванный округлыми пятнами правильной формы, на которых бактерии отсутствуют. Эти пятна — свидетельство уничтожающей деятельности бактериофагов (фото 51).
При наблюдении в электронном микроскопе соприкосновения бактериофага с бактерией трудно установить, какая часть фага проникает в клетку и что остается снаружи (если остается!). Читатель может справедливо заметить, что рассказ о проникновении ДНК фага в бактериальную клетку и о том, что внешние его оболочки остаются вне этой клетки, является плодом фантазии. Каким же образом доказать то, о чем даже электронный микроскоп не может дать достаточно четкой информации?
В иерархии субмикрокосмоса существуют, однако, еще более мелкие единицы — атомы радиоактивных изотопов (их вирусологи и призывают в подобных случаях на помощь). Молекулы соединений, содержащие такие изотопы, легко отличить от других молекул. Они выделяются своей радиоактивностью, которая измеряется точными и чувствительными приборами.
В 1952 году два исследователя, А. Херши и М. Чейз, одновременно призвали на помощь радиоактивные изотопы: фосфор 32Р и серу 35S. Почему именно эти, а не другие? Да потому, что фосфор встречается только в ДНК бактериофагов, а сера может входить только в состав их белков.
Культуру бактерий выращивали на питательной среде, содержавшей в качестве источника биогенного фосфора исключительно 32Р. Практически бактерии не могут отличить радиоактивный фосфор от обычного и потребляют среду с 32Р. Таким путем атомы с 32Р попадают в бактериальные клетки, которые затем могут стать добычей бактериофагов. И 32Р уже входит в состав ДНК бактериофагов. Подобный опыт повторили в другой пробирке, с радиоактивными соединениями серы 35S, и получили бактериофаги, имеющие в своем белке 35S.
Этими фагами и инфицировали потом бактерии, выращенные в среде, не содержащей радиоактивных соединений. Сначала использовались бактериофаги с радиоактивной серой. Процесс инфицирования был завершен в течение нескольких минут, после чего центрифугированием отделили зараженные бактерии от остатков бактериофага и определили их радиоактивность. У бактерий не было и признаков радиоактивности, тогда как «опустошенные» фаги (головки и хвостовые придатки) проявляли повышенную радиоактивность. Значит, в бактерии проникла из фага только ДНК (не содержащая серы!), в то время как белок, в состав которого входила 35S, остался вне клеток.
Потом последовал опыт с фагами, содержащими в своей ДНК радиоактивный фосфор (белки фагов фосфора не содержат!). Через несколько минут после заражения бактерий остатки фагов и зараженные бактерии были тем же способом разделены и исследованы на радиоактивность. На этот раз она была обнаружена в клетках бактерий! Таким образом, было достоверно доказано, что при поражении бактерий фагами внутрь бактериальных клеток проникает ДНК фага (содержащая фосфор), а снаружи остается его белковая оболочка (содержащая серу).
Из рассказа о бактериофагах, принуждающих клетки бактерий к синтезу ДНК и белкового компонента фагов, мы узнали, что один-единственный фаг может вызвать среди бактерий настоящую эпидемию и за короткий срок уничтожить в жидкой питательной среде миллиарды их клеток.
Но при некоторых обстоятельствах появление бактериофага у микробной клетки не обязательно заканчивается ее гибелью. ДНК из фага проникает в клетку, однако, клетка продолжает жить, как будто бы ничего не произошло. Это напоминает проникновение в команду корабля замаскированных пиратов, которые под видом дружески настроенных матросов тайно подготавливают диверсию, выжидая лишь подходящего момента… Пораженная бактерия продолжает внешне беспрепятственно расти и время от времени в соответствующих условиях делиться на две новые клетки…
Но что-то изменилось в ее свойствах — бактерия приобрела устойчивость к фагам определенного типа. И это является единственным свидетельством того, что в ее клетке находится фаговая ДНК. Специалисты говорят в таких случаях о неинфекционных, или симбиотических, фагах и лизогенных[24] бактериях. «Лизогенных» — потому что в какой-то момент по якобы совершенно непонятной причине 2–3 клетки из миллиарда вдруг расплачиваются за свое гостеприимство и погибают. А из погибших клеток вырываются в среду сотни бактериофагов. Достаточно перенести одну капельку этой среды в другую культуру восприимчивых бактерий, чтобы разразилась катастрофа и почти вся культура в короткий срок погибла.
Почти, но не вся! Некоторые клетки переживут атаку бактериофагов. Но эти счастливчики, перенесшие первый удар, как-то изменятся, приобретут новые свойства и передадут их следующему поколению.
Что же, собственно, при этом происходит? Дж. Ледерберг из Станфордского университета (Калифорния), первый наблюдавший это явление, объясняет его следующим образом. После проникновения фаговой ДНК в лизогенную бактерию обычного размножения фагов не происходит и гибель клетки не наступает. В этом случае фаговая ДНК присоединяется к бактериальной, которая находится в хромосоме клетки. Когда же эта клетка начинает делиться на две дочерние, разделяется и хромосома, причем вдвое увеличивается и количество ДНК из фага и половина ее попадает в каждую из новых хромосом. Итак, при каждом дальнейшем делении клеток фаговая ДНК переносится в каждую из дочерних клеток. Среди миллиардов клеток, естественно, окажутся и такие, в которых фаговая ДНК освободится из хромосомы и начнет бурно размножаться, а клетка погибнет. В некоторых из них ДНК фага захватывает с собой и частичку клеточной хромосомы, и новообразовавшиеся частицы фага содержат в этом случае, кроме собственной ДНК, «кусочек» бактериальной хромосомы. Когда такой фаг встречается с другой восприимчивой клеткой, то вместе с фаговой ДНК в нее попадает частица бактериальной ДНК, и они уже совместно присоединяются к хромосоме новой клетки-хозяина. Фрагмент чужой хромосомы сливается с хромосомой этой клетки, и последняя обогащается, таким образом, новыми генами. Внешне это проявится в приобретении клеткой какого-то нового свойства. Если, например, чужеродный ген определял синтез вещества, которое до этого «обогатившаяся» клетка не могла образовывать, то эту способность получала не только сна сама, но и ее потомство. Приобретенным свойством она обязана гену, попавшему в клетку с помощью бактериофага. Ледерберг назвал такую форму наследственных изменений трансдукцией.
При помощи «бактериофага 80» методом трансдукции удалось перенести свойство устойчивости к пенициллину на бактерию, ранее проявлявшую повышенную восприимчивость к этому антибиотику. Этот же бактериофаг перенес свойство устойчивости и на два других антибиотика, но в данном случае далеко не все «фаги 80» приняли участие в трансдукции, ее осуществлял только один из миллиона.
Ледерберг и его старший коллега Тейтем открыли еще одно важное свойство бактерий. Они установили, что кишечные бактерии Escherichia coli имеют половые различия. Одни клетки проявляют характер женских индивидов, другие — мужских. Методом, описанным в следующем разделе, из этих бактерий были выделены два различающихся штамма (мутанта): один из них нуждается в ростовых веществах биотине (Б) и метионине (М), другой — в лейцине (Л) и треонине (Т). Первый штамм ученые стали обозначать формулой Б-М-Т+Л+, а второй — Б+М+Т-Л-, где знак плюс отражает способность, а знак минус — неспособность штаммов синтезировать то или иное ростовое вещество.
Из каждого штамма взяли по 10 миллионов клеток, смешали их и посеяли на агаризованную среду, в которой не было ни одного из упомянутых ростовых веществ. Обычно ни тот ни другой тип бактерий на таком агаре не развивались, так как обоим не хватало по два ростовых вещества. И тем не менее на агаре появилось около ста колоний. Чем это объяснить? Исследования Ледерберга и Тейтема показали, что в разросшихся колониях все бактерии были нового типа (Б+М+Т+Л+). По-видимому, некоторые клетки из обоих штаммов конъюгировали между собой, причем мужская клетка передала женской клетке часть своей хромосомы, именно ту ее часть, в которой были гены, определяющие способность синтеза двух ростовых веществ, ранее не вырабатывавшихся «женской» клеткой. Теперь она стала самостоятельной и, получив в своей хромосоме два новых гена, приобрела возможность образовывать все четыре ростовых вещества.
Несколько позднее с помощью электронного микроскопа было установлено, что при конъюгации (как назвали этот процесс Ледерберг и Тейтем) две бактерии действительно соединяются друг с другом «копуляционным мостиком» (фото 52). При этом мужская клетка отдает часть своей хромосомы женской клетке.
Жакоб из Пастеровского института со своим коллегой Э. Вольманом придумали оригинальный метод наблюдения за ходом конъюгации у бактерий. Они смешали мужской и женский типы бактерий в жидкой среде и через определенные промежутки времени отбирали пробы, помещая их затем в смеситель и продолжительно встряхивая, чтобы отделить друг от друга соединившиеся клетки. Затем они, так же как Ледерберг и Тейтем, зарегистрировали увеличение числа новых генов в «женских» клетках. Обозначим гены «мужской» хромосомы буквами А — Б—В — Г—Д — Е—Ж—3 и проследим вместе с Вольманом и Жакобом с часами в руках их перемещение из «мужских» клеток в «женские» (см. рис. на стр. 146)
Смешивать культуры «мужских» и «женских» бактерий они начали ровно в 9 часов. В 9.05 брали первую пробу, в 9.10 — вторую, в 9.20 — третью, в 9.30 — четвертую и в 9.35 — пятую. Затем встряхиванием разделяли спаренные клетки и, пересеяв их на агар, оставляли до следующего дня. И вот каков был результат: по прошествии 5 мин «женские» клетки не содержали еще ни одного «мужского» гена; через 10 мин в них был уже ген А, через 20 мин — гены А и Б, через 30 мин — гены А, Б и В, а спустя 35 мин положение уже не изменялось. Таким образом, конъюгация позволила «женским» клеткам получить три новых гена. А это означает, что они стали уже иными. Обогатившись тремя генами, они приобрели и иные свойства, которые передадутся следующим поколениям. Бактерии изменили свою природу!
Рассказ о трансформации, трансдукции и конъюгации должен был убедить читателя, что микроорганизмы действительно могут изменять свою природу. Во всех рассмотренных случаях микробиологи использовали влияние генетического материала (ДНК) одних микробов на наследственные свойства других.
А теперь познакомимся с некоторыми примерами наследственных изменений, которые мы можем получить у микроорганизмов в лаборатории или же наблюдать в природе. Резкое, передаваемое по наследству изменение какого-нибудь свойства организмов называется мутацией. Современная биология накопила уже немало примеров внезапных (в масштабе одного поколения) изменений некоторых признаков растений, животных или микробов, которые наследуются следующими поколениями.
Мутации в природе возникают спонтанно («сами собой») или могут быть вызваны действием так называемых мутагенных факторов, к которым относятся некоторые химические вещества и различные формы излучений (ультрафиолетовое, рентгеновское или радиоактивное). Теперь для нас уже не является неожиданностью, когда какие-нибудь мутагенные факторы затрагивают генетический аппарат клетки и вызывают структурные изменения хромосом или влияют на молекулы ДНК в генах.
Схема Жакоба — Вольмана, показывающая последовательность перемещения генов из мужских клеток (правая о каждой паре) в женские во время конъюгации, которая продолжается 35 мин.
Первые статистически достоверные сведения о «химических» последствиях мутаций дали, как и следовало ожидать, микроорганизмы. На этот раз микробиологи избрали в качестве подопытного организма не бактерии, а более сложные в биологическом отношении микроскопические грибы — Neurospora crassa. Известно, что этот гриб для синтеза составных частей своей клетки не требует никаких ростовых веществ (аминокислот, витаминов), так как сам образует их (за исключением биотина) из простых органических соединений. Остальные биогенные вещества он способен ассимилировать в виде минеральных солей (биотин все же добавляют в питательную среду). Если споры этого гриба облучить рентгеновскими или ультрафиолетовыми лучами и посеять на оптимальную для них питательную среду, они не прорастают и грибы, следовательно, не размножаются. При выяснении причин этого явления было установлено, что культура облученных спор уже нуждается в присутствии ростовых веществ. Таким образом, в результате облучения спор этого гриба была вызвана рецессивная мутация: N. crassa потеряла способность синтезировать необходимые ростовые вещества из простых соединений.
Нейроспора в настоящее время является классическим объектом микробиологической генетики, к которому постепенно присоединяется ряд других организмов. Мутации не только используются для изучения многих вопросов генетики, они служат также и промышленным целям. В пятой части нашей книги читатель узнает, каким образом микробиологи при помощи мутагенных факторов «принуждают» микробы, образующие пенициллин и другие антибиотики, повысить свою продуктивность. Если раньше Penicillium chrysogenum синтезировал на каждый миллилитр питательной жидкости только 5—10 единиц пенициллина, то сейчас его потомки производят до 10 и даже до 15 тысяч единиц.
При изучении мутаций удобным объектом могут быть и бактерии. За первые исследования в этой области, равно как и за изучение бактериофагов, в 1969 году Нобелевскую премию по физиологии и медицине получили три американских микробиолога — С. Лурия, М. Дельбрюк и А. Херши.
Дельбрюк был сначала физиком, но его всегда привлекала биология, в частности бактериофаги; именно на этом поприще он и познакомился с Лурия. Херши вместе с Мартой Чейз доказал, что инфекционным началом бактериофагов является нуклеиновая кислота, а не белок.
Лурия известен своим высказыванием о том, что «вирусы — это паразиты на генетическом уровне». Вместе с Дельбрюком он создал метод, известный под названием «флюктуационный тест». При помощи этого метода изучали мутации на бактериях Escherichia coli, которые в послевоенные годы были излюбленным объектом ученых. Своим флюктуационным тестом они доказали, что приобретенная бактериями устойчивость к бактериофагам связана с мутациями. При встрече с устойчивой клеткой бактериофаг терпит поражение, а клетка остается живой. Но таких «удачливых» бактерий бывает чрезвычайно мало — из 300 миллионов делящихся бактерий только одна-единственная может иметь шанс приобрести устойчивость к бактериофагам путем мутации!
Какова же генетическая сущность мутаций? Как генетикам удается разгадывать подоплеку этих явлений? Ведь даже изучение таких, казалось бы, простых организмов, как нейроспора, — очень трудная задача. Было бы значительно легче, если бы в нашем распоряжении имелись какие-то несложные «модели генетического материала» вроде комбинации нуклеиновой кислоты и белка, что-то подобное гену, который способен к «самовоспроизводству» и подвержен мутациям. Могут ли биологические объекты представить нам такую модель? Да, могут — такими моделями могли бы быть вирусы. Они отвечают всем этим требованиям.
Вирус табачной мозаики, который уже не раз помогал нам разгадать многие загадки жизни, предлагается и в качестве модели для изучения мутаций. ВТМ содержит рибонуклеиновую кислоту, которая, как мы увидим далее, выполняет ту самую генетическую роль, которую у других вирусов и живых клеток выполняет ДНК.
В Лаборатории вирусов Калифорнийского университета было положено начало изучению ВТМ; в распоряжении ученых имеется не только «нормальный» ВТМ, но и его мутанты, возникшие в результате происходящих в природе мутаций. Эти мутанты отличаются от нормального ВТМ симптомами вызываемого ими на листьях табака заболевания.
ВТМ и его мутанты послужили хорошими объектами при изучении химической природы мутаций. Сотрудники лаборатории сравнили прежде всего белковую часть ВТМ и мутанта, обозначаемого шифром J14D1. При изучении их белковых субъединиц, состоящих, как мы знаем, из 158 аминокислотных остатков, было обнаружено, что участие отдельных аминокислот неодинаково. Субъединицы мутанта J14D1 имели на одну молекулу лизина больше и на одну молекулу глютаминовой кислоты меньше, чем нормальный ВТМ.
Ученые пытались также уловить различия в молекулах РНК. Но это оказалось трудной задачей, поскольку расположение отдельных нуклеотидов в макромолекулах еще неизвестно. Однако процентное различие в РНК нормального ВТМ и РНК мутанта установить все же удалось. И эти данные были очень важны.
Теперь мы знаем, что РНК из ВТМ способна сама по себе вызвать заболевание табачной мозаикой. И если мутант J14D1 вызывает иное течение болезни, то это происходит потому, что он содержит иную РНК, которая в клетках пораженных растений заставляет ферменты синтезировать иную РНК и иные белковые субъединицы у вирусных частиц. Мы видели, что различия в этих субъединицах незначительны и касаются лишь двух аминокислот. Более заметны различия в самом действии нормального ВТМ и его мутанта: ВТМ вызывает на листьях молодых растений табака образование пузырьков и замедляет, но не останавливает их рост, тогда как мутант J14D1 приводит к быстрой гибели растений.
Сравнительное изучение было проведено и другими учеными, которые получили сходные результаты. Таким образом, исследования показали, что мутация у вирусов вызывала специфические изменения в структуре их нуклеиновых кислот и белков. Если считать вирусы неким подобием модели генов, можно предположить, что и в генах клеток, подверженных мутациям, происходят сходные химические изменения нуклеиновых кислот и белков. А это влечет за собой наследственные изменения некоторых свойств клетки.
Доказательства того, что РНК вирусов является генетическим материалом, предоставил нам все тот же ВТМ. Прежде всего ученым удалось изменить частицы ВТМ, устранив из их состава белковый компонент. В таком состоянии вирусы напоминали кусочки изолированного провода, с которого местами снят слой изоляции. Осталась нетронутой лишь РНК, однако инфекционные (вирулентные) свойства вируса сохранились. Затем ученые удаляли из ВТМ весь белок и снова испытывали вирулентные свойства частиц. Они все еще сохранялись, но стали приблизительно в 1000 раз слабее, чем неразрушенные частицы ВТМ.
Потом внимание ученых привлекли интересные опыты X. Френкель-Конрата. Очень тонкими химическими методами ему удалось отделить друг от друга РНК и белок ВТМ. Он доказал, что вирулентна лишь РНК. Затем он попытался снова связать разъединенные компоненты — белок и РНК. Ему удалась и эта операция. Воссоединение РНК с белком вернуло вирусу его прежнюю высокую инфекционность. Френкель-Конрат назвал это воссоединение компонентов вируса реконструкцией (фото 53).
На этом опыты не закончились. Впереди был наиболее сложный этап. В двух различных мутантах ВТМ (назовем их А и Б) Френкель-Конрат осторожно отделил РНК от белковой «оболочки». Потом, взяв белок из вируса А, он смешал его в пробирке с РНК, взятой из вируса Б. При этом были созданы как бы некие «перекрестные» вирусы: белковый цилиндр был от вируса А, а РНК — от вируса Б. Реконструкция, таким образом, удалась и в этом случае. Но каков был ее результат? Новый вирус обладал свойствами лишь того из прежних вирусов-мутантов, от которого была взята РНК, то есть свойствами вируса Б. О том, что это значит, говорит сам ученый:
«Этот опыт очень ярко иллюстрирует положение, согласно которому именно нуклеиновая кислота (РНК), а не белок является генетически активным материалом, важнейшим компонентом вируса, определяющим его характер и характер вызываемой им болезни».
Но можно ли на основании одних опытов с ВТМ делать столь обобщающие выводы? Рискованно. Правда, в настоящее время инфекционную РНК удалось выделить и из других РНК-содержащих вирусов: вируса полиомиелита и вируса энцефалита лошадей.
Мы говорили о мутантах ВТМ, созданных природой. Сегодня нам известны уже и его лабораторные мутанты. Первые из них увидели свет в лаборатории Г. Шрамма.
Шрамм в своих опытах исходил из возможности замены аминогруппы (—NH2) в молекуле цитозина гидроксильной группой (—ОН) при помощи азотной кислоты. При таком замещении цитозин преобразуется в урацил. Мы знаем, что и тот и другой содержатся в молекулах РНК.
Шрамм ставил себе целью действием азотной кислоты изменить расположение нуклеотидов в РНК и тем самым повлиять на ее свойства. Это оказалось нелегкой задачей. Сначала нужно было выделить РНК из вирусов, а потом воздействовать на нее азотной кислотой и уже измененную РНК снова «одеть» белковой «оболочкой». Однако все это Шрамму удалось, и в результате опытов были получены мутанты ВТМ, отличавшиеся особой формой действия на растения табака. Известно уже свыше 10 таких искусственно созданных мутантов ВТМ, и их свойства сейчас тщательно изучаются. Некоторые из них отличаются даже составом аминокислот, представленных в белковых субъединицах. Читатель знает, что изменение порядка расположения нуклеотидов в РНК вызывает и изменения в наборе аминокислот в белках, поскольку нуклеотиды являются как бы «генетическим алфавитом» при синтезе белков.
Мы видели, сколько биологических тайн, сколько важных вопросов генетики помог нам разрешить мир микроорганизмов. Многое удалось нам понять и объяснить. Но многое еще и не решено. Чего можно ожидать от дальнейших исследований? Попросим ответить на этот вопрос одного из участников исследований, уже немало сделавшего на этом поприще, Френкель-Конрата. Он пишет:
«Мы делаем пока только первые, робкие шаги. Начинаем разгадывать код, раскрывающий нам тайну соотношений структуры белков и нуклеиновых кислот. Постепенно нам все яснее становится путь переноса генетической информации. Многие ученые, работающие в области химии, освещают нам понемногу и механизм действия ферментов в клетке. И когда изучение генетической информации и исследования функций ферментов сольются в едином усилии, тогда, быть может, наши дети — а возможно, лишь наши внуки — начнут понимать ту высокоорганизованную взаимную игру ферментов и генетического материала, игру энергии и процессов воспроизводства, которую мы называем жизнью».
Информационную РНК (иРНК) называют также матричной и обозначают мРНК — Прим. ред.
Представление о переносе информации от ДНК к РНК и далее на белок называют основным постулатом, или центральной догмой, молекулярной биологии. — Прим. ред.
Лизогенные — несущие в себе возможности растворения клеток, их лизиса. — Прим. перев.